מה זה קלונינג - או איך בונים ב-DNA

הנדסה גנטית, לגו, בניית קונסטרקטים או בקיצור קלונינג - על מה מדובר ואיך זה נעשה?

מבוא קצר - גנים

נתחיל בהתחלה, הגנים בגופנו מקודדים לתכונות שונות כמו גובה, משקל וצבע.

הגנים הם אזורים ב-DNA שהנו החומר התורשתי, כל גן מורכב מאזור בקרה (פרומוטר), אזור מקודד ואזור סיום (טרמינטור). אזור הבקרה מציין מתי הגן יופעל. האזור המקודד מקודד לתכונה - חלבון או RNA שעושה עבודה מסויימת. אזור הסיום מציין את סוף הגן ומסמן למערכות ביטוי הגנים לעצור ולעבור לגן הבא.

עכשיו כשהבנו איך בנוי גן נוכל לשאול האם ניתן ליצור גנים חדשים?

נניח לקחת DNA שמקודד לחלבון זוהר ממדוזה (GFP), לחבר לאזור בקרה שיגרום לביטוי בעלים ובכלל להוביל את הכל בעזרת וירוס וכך ללמוד איך הוירוס מדביק צמחים.

במאמר זה אתאר כיצד עושים זאת.

שלב ראשון - ייצור מקטעי DNA

כפי שהבנתם בכדי ליצור גנים חדשים חומר הגלם הוא DNA ולאחר תיכנון ראשוני במחשב אנו מייצרים חקטעי DNA שהם אבני ה"לגו" שלנו.

נהוג להזמין היום מקטעים שגדלם 10 עד 5000 בסיסים (נוקלאוטידים) וניתן להזמין גם מקטעים גדולים יותר.

במידה ויש לכם את מקטע ה-DNA, נניח DNA גנומי של מדוזה, ניתן להגבירו ולהפיק רק את המקטע הרצוי בעזרת PCR.

פלסמידים

לפני שנמשיך צריך לציין שהעבודה נעשית ביצורים חיים, אם נבחן לרגע את המשימה שנתתי, את מבנה ה-DNA החדש, הגן שאנו בונים, צריך לגדל בחיידקים, וירוס וצמח. בכדי לגדל ולרבות DNA בחיידקים אנו משתמשים בפלסמידים, אלו הם כרומוזומים קטנים שיודעים להתקיים ולהתרבות בחיידקים.

מכאן, בעזרת PCR או סינטוז נקבל את אזור הבקרה, האזור המקודד לחלבון ואת אזור הסיום. בנוסף לחלקים אלה נכין גם פלסמיד שבעזרתו נוכל להרכיב ולגדל את הגן החדש.

הרכבת חתיכות ה-DNA

עכשיו עלנו להרכיב את כל החתיכות:

1. אנזימי הגבלה או אנזימי רסטריקציה יודעים לזהות רצף מסויים ב-DNA ולחתוך אותו. אם שני מקטעי DNA נחתכו ע"י אותו אנזים הם משלימים זה לזה וניתן לחברם בעזרת אנזים הנקרא ליגאז. לסרטון הסבר.
2. גולדן גייט - קיימים אנזימים הגבלה שמזהים רצף מסויים אך חותכים ליד רצף זה. בצורה זו ניתן ליצור כמות גדולה של מקטעים שמשלימים זה לזה אך אין בהם את האתר לאנזים ההגבלה. בצורה זו ניתן לחבר כמות גדולה של מקטעים באותו זמן ולבנות מבנים מורכבים של DNA. לסרטון הסבר.
3. גיבסון אסמבלי - שיטה זו אינה מחייבת שימוש באנזימי הגבלה והיא מאפשרת הרכבה של מספר מקטעי DNA. אל ריאקציית גיבסון אנו מגיעים עם מקטעי DNA ישרים (חשופים) ולכן תוצרי PCR מעולים לשיטה זו. חשוב לציין שקצוות מקטעי ה-DNA הומולוגיים (בעלי רצף זהה) בין רצפים שרוצים לחבר. האנזים הראשון הנו 5 אקסונוקליאז שמעכל את ה-DNA והופך אותו לחד גדילי. השלב הבא הנו היברידיזציה או השלמה בין המקטעים החופפים. עכשיו ניכנס האנזים DNA פולימראז לפעולה ומשלים את הרצפים שעוכלו ע"י האקסונוקלאז. לסיום מגיע הליגאז שסוגר את הפערים כפי שמוצג בסרטון.

ואחרי שהרכבנו את ה-DNA?

בשלב זה יש לנו בדר"כ פלסמיד ובו מקטע ה-DNA שרצינו, את הפלסמיד מכניסים לחיידקים לצורך ריבוי ומשם לאן שצריך:

בסרטון שבקישור תוכלו לצפות בעבודת מעבדה בחברת טארגטג'ן, הסרטון מתאר סריקה של מושבות חיידקים ב-PCR בכדי לאתר מי מהן מכילה את מבנה ה-DNA הנכון (לאחר שימוש בגולדן גייט). נראה את צלחות החיידקים, מכשיר ה-PCR, הרצת ה-DNA באלקטרופורזה ולבסוף הכנסתו לתאים. התאים שקבלו אתה-DNA שיצרנו זוהרים בצבע אדום ומייצרים את החלבונים אותם החברה רצתה לייצר.